一、文章介绍空间蛋白质组学技术近年来取得了长足进步常规可同时对20余种靶标进行成像极大克服了早期多重检测的限制。然而检测灵敏度不足仍然是制约其广泛应用的关键瓶颈特别是对于理解免疫反应和疾病机制至关重要的低丰度标志物。此外现有方法在多模态整合方面存在明显局限——大多数信号扩增技术如SABER、杂交链式反应、滚环扩增等虽然在某些方面表现出色但难以同时支持蛋白质和核酸的高重检测、兼容多种检测模式并在临床样本中实现稳定、可重复的扩增。酪酰胺信号放大TSA长期以来被广泛用于增强检测灵敏度但传统上受限于可沉积分子的类型而多重检测能力有限。近期研究表明条形码化的酪酰胺寡核苷酸可通过HRP催化沉积实现高重成像但多模态整合尚未得到验证。此外HRP偶联寡核苷酸与荧光染料酪酰胺结合虽能放大抗体信号但不可逆的共价荧光染料沉积限制了多重检测能力和样本重成像。为系统性地解决上述挑战Hendrik A. Michel、Paige McCallum及其合作者在Nature Methods上发表了题为“PASTA: versatile tyramide-oligonucleotide amplification for multimodal spatial biology”的研究论文提出了一种名为PASTAProtein and Nucleic Acid Serial Tyramide Amplification的多功能信号扩增技术。PASTA的核心原理是利用辣根过氧化物酶HRP催化酪酰胺-寡核苷酸共轭物在组织切片上的共价沉积。与传统荧光染料TSA不同沉积的寡核苷酸条形码在组织上保持稳定可实现延迟或重复成像并与现有空间技术无缝整合。PASTA的工作流程如下首先通过偶联抗体CODEX体系结合靶标然后通过寡核苷酸-HRP识别并结合到抗体条形码上催化不同条形码的酪酰胺-寡核苷酸B组沉积最后用荧光标记的互补寡核苷酸进行可视化。未扩增检测直接可视化A组条形码而PASTA通过B组条形码实现信号放大——关键设计是A组和B组使用不同序列因此PASTA不改变原始未扩增信号可在同一组织上实现“先成像、后放大”的灵活策略。PASTA展现出多项独特优势。信号增强可调——通过改变酪酰胺-寡核苷酸浓度实现可调灵敏度对CD3和Iba1等标志物实现数量级信号提升。事后标记物“抢救”——在初始成像后对表现欠佳的标志物如CAIX和CD4进行PASTA扩增无需额外组织切片即可从珍贵临床样本中挽救原本不可用的数据。多模态兼容——PASTA整合了原位杂交ISH检测病毒DNA/RNASIV、EBV、SARS-CoV-2、邻近连接分析PLA检测蛋白互作以及偶联困难的抗体通过非偶联一抗HRP二抗途径实现了真正的空间多组学。自动化高通量——在OpenTrons OT-2液体处理平台上开发了自动化流程显著减少手动操作时间和批次差异。高重ISH扩展——通过探针剥离和重探在同一FFPE切片上实现8个RNA靶标的多重检测并同时进行蛋白共检测。研究者通过B细胞淋巴瘤组织微阵列的综合验证展示了PASTA-CODEX整合了7种额外标志物ISH、偶联困难抗体和事后挽救标志物后与纯CODEX工作流程的细胞表型结果高度一致R²0.9874证明PASTA不显著改变细胞注释结果。二、算法原理介绍PASTA本质上是一种化学信号放大与多重解码技术而非传统意义上的“算法”其技术原理围绕“HRP催化寡核苷酸沉积 → 序列编码扩增 → 循环成像解码”三个核心环节展开。一HRP催化酪酰胺-寡核苷酸沉积。核心化学反应基于TSA原理HRP在H₂O₂存在下催化酪酰胺tyramide形成高反应性的自由基中间体这些自由基与邻近蛋白质的酪氨酸残基发生共价偶联约4-10 nm范围将偶联的寡核苷酸条形码稳定地“写”到组织上。与传统TSA使用荧光染料不同PASTA使用寡核苷酸作为“报告基团”。每个扩增循环包括1用HRP-寡核苷酸或生物素-寡核苷酸 HRP-链霉亲和素识别靶标2加入酪酰胺-寡核苷酸进行10-20分钟沉积3用含80% DMSO的剥离缓冲液化学剥离HRP-寡核苷酸5分钟×2次消除残余HRP活性。这个过程可重复进行序列多路复用每次沉积不同条形码实现多次连续扩增而不互相干扰。二双条形码编码策略。在CODEX体系中每个抗体偶联一个独特的寡核苷酸条形码A组约30-40 nt。PASTA引入第二组条形码B组同样30-40 nt通过HRP-寡核苷酸桥接A组和B组HRP-寡核苷酸与A组条形码互补HRP部分催化B组酪酰胺-寡核苷酸的沉积。关键设计在于A组和B组序列不同因此PASTA扩增信号与未扩增信号在解码时使用不同的荧光报告探针可在同一成像循环中区分且不改变原始抗体条形码。这种双码设计允许对同一靶标进行“先看基线再看放大”的灵活分析。三PASTA-CODEX整合工作流。PASTA-CODEX通过以下步骤实现多模态整合1常规CODEX染色——DNA条形码偶联抗体孵育过夜固定在微流控芯片上通过反复杂交-成像-剥离循环对A组条形码成像2PASTA扩增——在同一组织上事后或在CODEX染色前进行自动化扩增通过HRP-寡核苷酸桥连和酪酰胺-寡核苷酸沉积实现信号放大B组条形码同样通过荧光报告探针成像3ISH整合——RNAscope或DNAscope的HRP标记C1-C4探针经TSA非偶联抗体或PASTA偶联抗体显色4非偶联抗体整合——用未标记一抗HRP二抗通过PASTA沉积条形码5事后挽救——在初始成像后对弱信号标志物进行化学剥离和重新沉积实现“抢救”。所有图像通过VALIS配准用MESMER分割细胞PhenoGraph聚类注释实现标准化空间蛋白-核酸共分析。三、总结PASTA是一种基于HRP催化酪酰胺-寡核苷酸沉积的多功能空间信号扩增技术通过双条形码编码实现未扩增与扩增信号的独立检测支持可调灵敏度、事后挽救、多模态整合蛋白质、RNA、DNA、蛋白互作和高重ISH扩展。其核心创新在于将TSA的化学稳健性与寡核苷酸条形码的可编程性结合在同一FFPE组织上实现信号扩增与多组学信息解码的灵活组合且不影响后续细胞表型分析。PASTA在B细胞淋巴瘤TMA上整合了7种额外标志物与纯CODEX结果高度一致R²0.9874为从发现到临床转化的空间生物学研究提供了成本效益高、平台兼容性强且功能可扩展的技术方案。